طراحی و ارزیابی آزمایش واکنش زنجیره ای پلی مراز برای تشخیص ویروس ویرمی بهاره کپور

در دهه اخیر آبزی پروری در جهان بعنوان یک بخش اقتصادی و تولید غذا بسرعت در حال پیشرفت بوده است. به موازات آن بیماری های ویروسی پدیدار گشته واز یک مزرعه به مزرعه دیگر منتشر و باعث خسارت اقتصادی شده است. تشخیص صحیح پاتوژن ها در مراحل اولیه آلودگی یک نکته کلیدی برای کنترل بیماری در آبزی پروری محسوب می شود. ویروس بهاره کپور یک پاتوژن شدید کپورماهیان در قسمت های مختلف جهان محسوب شده و آن را در رده بیماری های لازم الاخطار ماهی در لیست oie طبقه بندی نموده اند. اهداف این مطالعه طراحی و ارزیابی آزمایش rt-pcr برای تشخیص ویروس svcو تعیین حساسیت و ویژگی این آزمایش است. در این تحقیق با استفاده از مخلوط سه پرایمر (پرایمرهای بیرونی svcf و svcr و یک پرایمر داخلی svcs) طراحی شده بر اساس مناطق حفاظت شده ژن g یک روش نیمه آشیانه ای rt-pcr طراحی گردید. ویژگی پرایمرهای طراحی شده (تنها پرایمرهای بیرونی) با انجام آزمایش بر روی vhsv و ihnv تایید گردید. برای بهینه سازی این آزمایش، تاثیر غلظت پرایمر، دمای اتصال پرایمر، تعداد سیکل و غلظت منیزیم بررسی گردید. همچنین برای پیشگیری از پاسخ منفی کاذب و اطمینان از صحت آزمایش، یک کنترل داخلی رقابتی (میمیک) طراحی و غلظت مناسب آن تعیین گردید. برای ارزیابی حساسیت آزمایش طراحی شده در ابتدا دو روش استخراج rnaبر اساس گوانیدین ایزوتیوسیانات- فنل کلروفرم (محلول استخراج rnx شرکت سیناژن ایران و کیت تجاری iq2000) و دو روش بر پایه استخراج ستونی (سینا پیور ایران و کیت استخراج rna روچ آلمان) که بصورت تجاری در دسترس هستند مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج نشان دادند که روش های بر پایه استخراج ستونی روچ آلمان و سیناپیور به ترتیب با غلظت های 77/36 نانوگرم بر میکرولیتر و 47/16 نانوگرم بر میکرولیتر میزان بیشتری rna استخراج گردید(p<0.05).سپس جهت تعیین حساسیت، rna استخراج شده (با کیت استخراج rna روچ آلمان) از رقت های متوالی جدایه svcv 56/70 (با عیار tcid50/ml105 ×9/1) که در تیره سلولی epc رشد یافته بود مورد آزمایش قرار گرفت. بمنظور مقایسه حساسیت، rnaاستخراج شده از رقت های متوالی ویروس همزمان با پرایمرهای طراحی شده توسط stone وهمکاران و کیت تجاری iq2000 نیز آزمایش شدند. نتایج نشان داد که آزمایش نیمه آشیانه ای rt-pcr طراحی شده قادر به تشخیص ویروس svc تا رقت 4-10 بود. آزمایش rt-pcr با استفاده از پرایمرهای stone وهمکاران نیز ویروس را تا رقت 3-10 ردیابی نمود اما با کیت تجاری iq2000 ویروس درهیچیک از رقت های مورد آزمایش شناسایی نشد. در عیارهای بالای ویروس، آزمایش طراحی شده منجر به ساخت دو قطعه dnabp 462 و bp 266 می شود اما با کاهش عیار ویروس قطعه bp 462 حذف می شود. همچنین قطعه dna میمیک (bp 729) تنها در هنگام پایین بودن عیار و یا عدم حضور ویروس (مانند کنترل منفی) تکثیر می گردد. پس از طراحی و بهینه سازی آزمایش در طی یک مطالعه میدانی 400 نمونه مشکوک کپور معمولی پرورشی از استخرهای دارای تلفات از 4 منطقه استان خوزستان در سال های 92-1391 جمع آوری و آزمایش شدند. حضور ویروس svc در این نمونه ها با کیتتجاری iq2000 نیز بررسی گردید. با انجام این آزمایش ها درهیچیک ازنمونه ها حضور ویروس svc تایید نگردید.